Создание микробных культур: подробное руководство для глобальных лабораторий и исследователей

Микробные культуры являются фундаментальными инструментами в широком спектре научных дисциплин, от фундаментальных исследований и биотехнологии до науки об окружающей среде и клинической диагностики. Способность успешно культивировать микроорганизмы in vitro имеет важное значение для изучения их характеристик, проведения экспериментов и разработки новых применений. Это всеобъемлющее руководство содержит подробный обзор принципов и практик, связанных с созданием и поддержанием микробных культур, с акцентом на передовые практики, устранение неполадок и соображения безопасности, актуальные для лабораторий по всему миру.

Понимание микробных культур

Что такое микробные культуры?

Микробная культура - это метод размножения микробных организмов, позволяющий им размножаться в заранее определенной культуральной среде в контролируемых лабораторных условиях. Микроорганизмы включают бактерии, грибы, вирусы, простейшие и водоросли. Культуры могут быть чистыми, содержащими только один тип организма, или смешанными, содержащими несколько видов.

Почему микробные культуры важны?

• Исследования: изучение микробной физиологии, генетики и поведения.
• Диагностика: выявление патогенов в клинических образцах.
• Биотехнология: производство фармацевтических препаратов, ферментов и других ценных продуктов.
• Наука об окружающей среде: анализ микробных сообществ в почве, воде и воздухе.
• Образование: обучение фундаментальным микробиологическим методам.

Основное оборудование и материалы

Для создания успешной лаборатории микробных культур требуется ряд специализированного оборудования и материалов:

• Инкубаторы: поддержание стабильной температуры и влажности для оптимального роста микробов. CO2-инкубаторы часто используются для культур эукариотических клеток, требующих контролируемого уровня CO2.
• Автоклавы: стерилизация сред, оборудования и отходов с использованием пара высокого давления.
• Ламинарные боксы (боксы биологической безопасности): обеспечение стерильной среды для работы с культурами, минимизируя риск загрязнения. Различные классы боксов биологической безопасности (класс I, II, III) предлагают различные уровни защиты для пользователя, образца и окружающей среды.
• Микроскопы: наблюдение за микробной морфологией и оценка чистоты культуры. Фазово-контрастная микроскопия может быть особенно полезна для просмотра живых неокрашенных клеток.
• Шейкеры/мешалки: обеспечение аэрации и перемешивания для жидких культур, способствуя равномерному росту.
• Пипетки и микропипетки: точный перенос жидкостей.
• Чашки Петри и пробирки для культур: контейнеры для твердых и жидких культур, соответственно.
• Стерильные тампоны и петли: перенос и посев культур.
• Среды для роста: обеспечение питательными веществами для роста микробов.
• Средства индивидуальной защиты (СИЗ): перчатки, лабораторные халаты, защита для глаз и маски для обеспечения личной безопасности.

Типы сред для роста

Выбор среды для роста имеет решающее значение для успешного культивирования микробов. Среды можно классифицировать на основе их состава, консистенции и назначения.

На основе состава

• Определенные среды (синтетические среды): содержат точно известные химические компоненты. Полезно для изучения конкретных потребностей в питательных веществах. Пример: минимальная среда M9 для E. coli.
• Сложные среды (натуральные среды): содержат ингредиенты неизвестного химического состава, такие как дрожжевой экстракт, пептон или говяжий экстракт. Обеспечивает широкий спектр питательных веществ и поддерживает рост многих микроорганизмов. Пример: Питательный бульон или бульон Лурия-Бертани (LB).

На основе консистенции

• Твердые среды: содержат отверждающий агент, обычно агар. Используется для выделения чистых культур и наблюдения за морфологией колоний. Пример: питательный агар или агар МакКонки.
• Жидкие среды (бульон): не содержат отверждающего агента. Используется для выращивания большого количества микроорганизмов. Пример: триптический соевый бульон (TSB).
• Полутвердые среды: содержат низкую концентрацию агара (обычно <1%). Используется для тестирования подвижности.

На основе назначения

• Селективные среды: содержат ингредиенты, которые подавляют рост определенных микроорганизмов, позволяя расти другим. Используется для выделения определенных типов микроорганизмов из смешанной популяции. Пример: агар МакКонки (селективный для грамотрицательных бактерий) или солевой агар Маннитола (MSA), который селективен для видов Staphylococcus и дифференцирует *Staphylococcus aureus* от других *Staphylococcus* на основе ферментации маннитола.
• Дифференциальные среды: содержат ингредиенты, которые позволяют различать различные типы микроорганизмов на основе их метаболической активности. Пример: кровяной агар (дифференцирует бактерии на основе гемолиза) или агар Эозин Метиленовый Синий (EMB), который дифференцирует *E. coli* (металлический зеленый блеск) от других колиформных бактерий.
• Среды обогащения: содержат специфические питательные вещества, которые способствуют росту конкретного микроорганизма, позволяя ему вытеснять другие организмы в образце. Они используются, когда целевой организм присутствует в небольшом количестве. Пример: селенитовый бульон, используемый для обогащения видов *Salmonella*.

Пример: выбор правильной среды для культуры *E. coli* Чтобы вырастить общую культуру *E. coli*, обычно используют бульон или агар LB. Если вы хотите отобрать штаммы *E. coli*, которые могут ферментировать лактозу, вы можете использовать агар МакКонки. Если вы изучаете определенные метаболические пути, вы можете использовать определенную среду, такую как M9, для контроля доступных питательных веществ.

Этапы создания микробной культуры

Процесс создания микробной культуры обычно включает следующие этапы:

1. Подготовка сред для роста

Подготовьте соответствующую среду для роста в соответствии с инструкциями производителя или установленными лабораторными протоколами. Обычно это включает в себя:

• Взвешивание необходимых ингредиентов.
• Растворение ингредиентов в дистиллированной или деионизированной воде.
• Регулировка pH до желаемого уровня.
• Добавление агара (при приготовлении твердой среды).
• Стерилизация среды автоклавированием.

Важные соображения:

• Точность: точные измерения имеют решающее значение для воспроизводимых результатов. Используйте калиброванные весы и объемную стеклянную посуду.
• Стерильность: убедитесь, что все компоненты среды и сосуды для приготовления стерильны, чтобы предотвратить загрязнение.
• Регулировка pH: проверьте pH среды с помощью откалиброванного pH-метра. Большинство бактерий оптимально растут вблизи нейтрального pH (около 7,0). Грибы часто предпочитают слегка кислые условия.

2. Стерилизация

Стерилизация необходима для уничтожения любых нежелательных микроорганизмов, которые могут загрязнить культуру. Общие методы стерилизации включают в себя:

• Автоклавирование: использование пара высокого давления при 121 °C в течение 15-20 минут. Это наиболее распространенный метод стерилизации среды, оборудования и отходов.
• Фильтрационная стерилизация: пропускание жидкостей через фильтр с размером пор, достаточно маленьким для удаления микроорганизмов (обычно 0,22 мкм). Используется для термочувствительных растворов, которые нельзя автоклавировать. Пример: стерилизация растворов антибиотиков.
• Стерилизация сухим жаром: использование высоких температур (160-180 °C) в течение 1-2 часов. Используется для стерилизации стеклянной посуды и других термостойких предметов.
• Химическая стерилизация: использование химических дезинфицирующих средств, таких как этанол или отбеливатель, для стерилизации поверхностей и оборудования.

Передовые методы автоклавирования:

• Убедитесь, что автоклав правильно обслуживается и откалиброван.
• Не перегружайте автоклав.
• Используйте соответствующие контейнеры для автоклавирования жидкостей, чтобы предотвратить выкипание.
• Дайте автоклаву полностью остыть, прежде чем открывать его, чтобы предотвратить ожоги.

3. Инокуляция

Инокуляция - это процесс введения желаемого микроорганизма в стерильную среду для роста. Это можно сделать с помощью различных методов, в зависимости от источника инокулята и типа подготавливаемой культуры.

• Из чистой культуры: перенос небольшого количества существующей культуры в новую среду с помощью стерильной петли или тампона.
• Из смешанной культуры: выделение отдельных колоний на твердой среде путем посева для изоляции.
• Из клинического образца: нанесение образца на среду или суспендирование образца в жидкой среде.
• Из образцов окружающей среды: использование серийных разведений и методов посева для получения подсчитываемых колоний.

Посев для изоляции: Этот метод используется для получения чистых культур из смешанной популяции бактерий. Он включает в себя разбавление бактериального образца путем многократного нанесения его на поверхность твердой агаровой пластины. Цель состоит в том, чтобы получить хорошо изолированные колонии, каждая из которых происходит из одной бактериальной клетки.

Пример: посев для изоляции *E. coli* 1. Стерилизуйте петлю, нагревая ее на огне докрасна, а затем дайте ей остыть. 2. Окуните петлю в образец, содержащий *E. coli*. 3. Проведите петлей по одному участку агаровой пластины. 4. Снова нагрейте петлю на огне и дайте ей остыть. 5. Проведите от первого участка ко второму, увлекая за собой часть бактерий. 6. Повторите процесс нагревания и посева для третьего и четвертого участков. 7. Инкубируйте пластину при 37 °C в течение 24-48 часов. Изолированные колонии должны образовываться в более поздних участках посева.

4. Инкубация

Инкубация включает в себя обеспечение соответствующих экологических условий для роста микробов. Обычно это включает в себя контроль:

• Температура: большинство бактерий оптимально растут при 37 °C (температура тела человека), но некоторым могут потребоваться более низкие или высокие температуры. Грибы часто предпочитают более низкие температуры (25-30 °C).
• Атмосфера: некоторым микроорганизмам требуются определенные атмосферные условия, такие как наличие или отсутствие кислорода или повышенный уровень углекислого газа. Аэробные бактерии нуждаются в кислороде для роста, а анаэробные бактерии не переносят кислород.
• Влажность: поддержание достаточной влажности предотвращает высыхание среды.
• Время: время инкубации варьируется в зависимости от микроорганизма и среды для роста. Бактерии обычно растут быстрее, чем грибы.

Соображения по инкубации:

• Контроль температуры: используйте калиброванные инкубаторы для обеспечения точного контроля температуры.
• Контроль атмосферы: используйте анаэробные банки или CO2-инкубаторы для создания определенных атмосферных условий.
• Мониторинг: регулярно контролируйте культуры на предмет роста и загрязнения.

5. Мониторинг и поддержание

Регулярный мониторинг необходим для обеспечения правильного роста культуры и ее защиты от загрязнения. Это включает в себя:

• Визуальный осмотр: проверка наличия признаков роста, таких как помутнение в жидкой среде или образование колоний на твердой среде.
• Микроскопическое исследование: наблюдение за морфологией клеток и оценка чистоты культуры. Окрашивание по Граму - распространенный метод дифференциации бактерий.
• Пересев: перенос части культуры в свежую среду для поддержания жизнеспособности и предотвращения истощения питательных веществ.
• Хранение: сохранение культур для длительного хранения путем замораживания или лиофилизации (высушивания замораживанием).

Асептический метод: предотвращение загрязнения

Асептический метод - это набор процедур, предназначенных для предотвращения загрязнения культур и поддержания стерильной среды. Ключевые принципы асептического метода включают в себя:

• Работа в ламинарном боксе: обеспечение стерильного рабочего пространства.
• Стерилизация оборудования: нагревание петель и игл на огне, автоклавирование среды и стеклянной посуды.
• Использование стерильных расходных материалов: использование предварительно стерилизованных одноразовых расходных материалов или стерилизация многоразовых расходных материалов перед использованием.
• Минимизация воздействия воздуха: работайте быстро и эффективно, чтобы свести к минимуму время, в течение которого культуры подвергаются воздействию воздуха.
• Правильная гигиена рук: тщательно мойте руки до и после работы с культурами.

Примеры асептического метода на практике:

• Открытие стерильной чашки Петри: лишь слегка приподнимите крышку, чтобы свести к минимуму воздействие воздуха.
• Перенос культуры: нагрейте горлышко пробирки с культурой на огне до и после переноса культуры.
• Подготовка среды: используйте стерильную воду и стеклянную посуду и автоклавируйте среду сразу после приготовления.

Устранение распространенных проблем

Несмотря на тщательное планирование и выполнение, при создании микробных культур иногда могут возникать проблемы. Вот некоторые распространенные проблемы и их потенциальные решения:

• Нет роста:
  • Возможная причина: неправильная среда для роста, неправильная температура инкубации, нежизнеспособный инокулят, наличие ингибиторов.
  • Решение: убедитесь, что среда для роста подходит для микроорганизма, проверьте температуру инкубации, используйте свежий инокулят и убедитесь, что в среде нет ингибиторов.
• Загрязнение:
  • Возможная причина: плохая асептическая техника, загрязненная среда или оборудование, переносимые по воздуху загрязнители.
  • Решение: пересмотрите и усильте асептическую технику, правильно стерилизуйте все среды и оборудование и работайте в ламинарном боксе. Используйте антибиотики или противогрибковые средства в среде (когда это уместно) для подавления роста загрязнителей.
• Медленный рост:
  • Возможная причина: неоптимальные условия роста, истощение питательных веществ, накопление токсичных побочных продуктов.
  • Решение: оптимизируйте условия роста (температура, атмосфера, pH), обеспечьте свежую среду и аэрируйте культуру для удаления токсичных побочных продуктов.
• Смешанная культура:
  • Возможная причина: загрязнение исходного инокулята, неполная изоляция во время посева.
  • Решение: получите чистую культуру из надежного источника, повторите посев для изоляции и используйте селективную среду для подавления роста нежелательных микроорганизмов.

Соображения безопасности

Работа с микроорганизмами требует соблюдения строгих протоколов безопасности для защиты персонала и предотвращения выброса потенциально опасных организмов в окружающую среду.

Уровни биобезопасности

Микроорганизмы классифицируются по уровням биобезопасности (УББ) в зависимости от их потенциала вызывать заболевания. Каждый УББ требует определенных методов сдерживания и оборудования для обеспечения безопасности.

• УББ-1: микроорганизмы, которые, как известно, не вызывают заболеваний у здоровых взрослых. Пример: Bacillus subtilis. Требуются стандартные микробиологические методы и СИЗ.
• УББ-2: микроорганизмы, которые представляют умеренный риск заболевания. Пример: Staphylococcus aureus. Требуются практики УББ-1 плюс ограниченный доступ, предупреждающие знаки биологической опасности и меры предосторожности для острых предметов. Работа с аэрозолями должна проводиться в боксе биологической безопасности.
• УББ-3: микроорганизмы, которые могут вызывать серьезные или потенциально смертельные заболевания при вдыхании. Пример: Mycobacterium tuberculosis. Требуются практики УББ-2 плюс контролируемый доступ, направленный воздушный поток и защита органов дыхания. Все работы должны проводиться в боксе биологической безопасности.
• УББ-4: микроорганизмы, которые очень опасны и представляют высокий риск для жизни. Пример: вирус Эбола. Требуются практики УББ-3 плюс полная изоляция, специализированные системы вентиляции и защитные костюмы для всего тела.

Общие правила техники безопасности

• Носите соответствующие СИЗ: перчатки, лабораторные халаты, защиту для глаз и маски.
• Соблюдайте правила гигиены рук: тщательно мойте руки до и после работы с культурами.
• Обеззаразьте рабочие поверхности: дезинфицируйте поверхности соответствующим дезинфицирующим средством до и после использования.
• Правильно утилизируйте отходы: автоклавируйте или сжигайте загрязненные отходы.
• Сообщайте о разливах и несчастных случаях: следуйте установленным протоколам для сообщения и устранения разливов.
• Пройдите надлежащее обучение: убедитесь, что весь персонал обучен микробиологическим методам и процедурам безопасности.

Долгосрочное сохранение культуры

Сохранение микробных культур для длительного хранения имеет решающее значение для поддержания ценных штаммов и избежания необходимости многократно выделять и культивировать организмы. Общие методы сохранения включают в себя:

• Охлаждение: хранение культур при 4 °C для краткосрочного сохранения (от недель до месяцев).
• Замораживание: хранение культур при -20 °C или -80 °C в криопротекторном агенте, таком как глицерин. Этот метод может сохранять культуры в течение многих лет.
• Лиофилизация (высушивание замораживанием): удаление воды из культуры путем замораживания с последующей сушкой в вакууме. Этот метод может сохранять культуры в течение десятилетий.

Передовые методы замораживания культур:

• Используйте криопротекторный агент для предотвращения образования кристаллов льда, которые могут повредить клетки. Глицерин является широко используемым криопротекторным агентом.
• Замораживайте культуры медленно, чтобы вода могла выйти из клеток. Используйте морозильник с регулируемой скоростью или поместите культуры в морозильник с температурой -20 °C на несколько часов, прежде чем переносить их в -80 °C.
• Храните замороженные культуры в криовиалах с герметичными уплотнениями.
• Четко маркируйте пробирки с указанием названия штамма, даты замораживания и любой другой необходимой информации.

Заключение

Создание и поддержание микробных культур - это фундаментальный навык для исследователей, клиницистов и преподавателей по всему миру. Понимая принципы асептического метода, выбирая подходящие среды для роста и внедряя надлежащие протоколы безопасности, вы можете успешно культивировать микроорганизмы для широкого спектра применений. Это руководство предоставляет всеобъемлющую основу для наращивания вашего опыта в методах культивирования микробов и внесения вклада в прогресс в различных научных областях. Помните, что последовательная практика, тщательное внимание к деталям и приверженность безопасности необходимы для достижения надежных и воспроизводимых результатов.